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PCR 核酸检测试剂盒 | MedChemExpress
2021年09月23日 09:55   学术化工

关键字:核酸检测,PCR
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核酸检测是咋回事?
 

首先yb网站需要知道:就现有检测手段来说,检测的是样品中病毒核酸片段,而非完整的病毒核酸,更不是活病毒。新冠患者治愈后,活病毒被免疫系统清除,但是体内可能仍然存在病毒核酸碎片,因此核酸检测结果仍可能呈阳性。此时的阳性结果,不代表患者体内一定存在完整的病毒核酸或者活病毒!

 

目前核酸检测主要的操作是,采取咽拭子或鼻拭子,取样后,做病毒核酸的实验室检测:提取标本中的 RNA,并逆转成 cDNA,用病毒 cDNA 的特异性引物进行 PCR 扩增。如扩增的产物,出现病毒特异性的 DNA,则病毒核酸检测结果为阳性。

 

新型冠状病毒 (SARS-CoV-2) 是一种 RNA 病毒,新冠病毒患者样本含病毒的遗传物质 RNA,核酸检测大概率呈阳性。(核酸结果阴性也不能排除病毒感染,要结合症状、血常规及肺部 CT 等检查,逐一分析,综合判断。)

 

 
应用 PCR 技术进行核酸检测
 
 
PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应):基本原理类似于 DNA 的体内复制,特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。新型冠状病毒是一种 RNA 病毒,所以yb网站主要介绍一下 RT-PCR。
 
RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,逆转录聚合酶链式反应) 提取组织或细胞中的总 RNA,以其中的 mRNA 为模板,采用 Oligo(dT) 或随机引物,利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
 

基于 RT-PCR 进行的核酸检测[1]

 

RT-PCR 可以定性,但不能定量。所以这里yb网站需要介绍一下它的升级版——实时荧光定量 PCR (Real-time RT-PCR),就是结合了荧光定量技术的反转录 PCR:先从 RNA 反转录得到 cDNA,然后再用 Real-time PCR 进行定量分析。在反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程。最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过 Ct 值对模板进行相对定量分析。
 
 
案例分析
 
 

 

实验设计:

分别以 SYBR Green qPCR Master Mix、Primer 和 ddH2O 点样跑电泳。

 

问题:

为什么单独用 Mix 跑核酸电泳会有一个小条带?

 

萌 Cece 解答:

此款 qPCR Mix 所用的酶为配体法修饰的热启动 DNA 聚合酶,该配体为核酸。因此直接用酶跑电泳时,会存在一个小条带。


收!说了这么多,讲重点!针对核酸检测中的假阴性问题,有没有完美的解决方案呢?

额~目前还没有新冠检测筛查金标准。所以联合检测手段是目前比较可靠的方式,即同时应用 2 种或 2 种以上诊断方式来检测。目前的检测手段有鼻拭子和咽拭子、肺泡灌洗液检验、血液抗体检测、粪便和肛拭子,及胸片/CT 等影像学等手段,还可以结合环境样本和阴性对照做验证排除。

 

多种新冠病毒检测手段阳性率的对比[2]

 

做 PCR 时出现假阴性是什么原因呢,又该怎么应对?别担心,萌 Cece 有妙招!
 
问题 1:模板问题

萌 Cece 分析解答:模板可能包含杂蛋白。建议配制稳定有效的消化处理液。同时,模板的溶解液固定不变 (比如:Tris-HCl 缓冲液)。

 

问题 2:引物问题

萌 Cece 分析解答:引物可能质量不太好,或者浓度设计不合适,及引物设计不合理,如长度不够,引物本身或两条引物之间形成二聚体等。建议更换引物。引物应高浓度小量分装保存,以防止反复冻融或长期冷冻保存,导致引物的变质降解失效。

 

问题 3:Mg2+ 浓度

萌 Cece 分析解答:Mg2+ 浓度对 PCR 扩增效果影响极大,浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性,过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败,出现假阴性。建议设置一组反应,每一反应中的其他离子浓度相同 (如 Tris、KCl 等),而 MgCl2 浓度不同,来摸索最佳浓度。

 

问题 4:设计因素

萌 Cece 分析解答:变性温度低,时间短;退火温度过高,影响引物与模板的结合而降低扩增效率;延伸时间过短。建议提高变性温度,延长变性时间,尤其首次循环。退火温度应根据 Tm 值来设定。延伸时间必要时适当延长。

 

除此之外,就是最讨厌的“出现非特异性扩增带


萌 Cece 分析解答:Mg2+ 浓度过高,退火温度过低,PCR 循环次数过多;酶的质量不过关;引物与靶序列不完全互补,或引物聚合形成二聚体,都有可能出现非特异性扩增带。建议适当提高退火温度;更换新酶;降低引物量,适当增加模板量,减小循环次数。必要时重新设计合成引物。

 

说这么多就不得不提一下yb网站 MCE 众多的 Pre-Mix 即用型预混液,操作 so easy!

 

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参考文献

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1. Nidhi Verma, et al. Emerging diagnostic tools for detection of COVID-19 and perspective. Biomed Microdevices. 2020 Nov 24;22(4):83.

2. Wenling Wang, et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 2020 May 12; 323(18): 1843-1844.